一、BrainBits星形膠質(zhì)細(xì)胞全腦培養(yǎng)試劑盒內(nèi)容

該試劑盒內(nèi)含：1 E18小鼠全腦、12mL NbAstro、6.2mg木瓜蛋白酶、5mL HE-Ca 、1個(gè)帶橡膠球的火拋光移液、1對(duì)PDL涂層蓋板

二、BrainBits星形膠質(zhì)細(xì)胞全腦培養(yǎng)試劑盒產(chǎn)品簡(jiǎn)介

該試劑盒包含從新鮮組織開始培養(yǎng)所需的一切。E18組織用2ml含B27的THRYVE胚胎儲(chǔ)存介質(zhì)運(yùn)送。立即使用組織以獲得最高的細(xì)胞產(chǎn)量，但組織可在4-8°C下保存一周。這個(gè)試劑盒是完mei的研究人員剛剛開始或?yàn)槟切┱l(shuí)想要的可靠性。非常適合課堂教育，為下一代研究人員提供實(shí)踐方法。

三、產(chǎn)品操作

（1）細(xì)胞分散（無(wú)菌操作箱中的室溫）

A、用 2 毫升移液管小心地將組織轉(zhuǎn)移至木瓜蛋白酶中，盡量減少培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移。將 THRYVE 胚胎完quan培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的無(wú)菌 15 毫升管中，以備第三步使用。

B、將組織和木瓜蛋白酶在30℃下孵育 10 分鐘。每 2 分鐘輕輕攪拌一次，或者使用加熱振蕩板，溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為 150 轉(zhuǎn)/分鐘。

C、用 2 毫升移液管從木瓜蛋白酶中取出含有少量培養(yǎng)基的組織，并返回步驟 A中的 THRYVE 胚胎完quan培養(yǎng)基中。

D、使用涂有硅油的巴斯德移液管，研磨組織不超過(guò) 10 次，或分散 90%的組織，避免產(chǎn)生氣泡。

E、讓未分散的顆粒靜置 1 分鐘。可選：向細(xì)胞懸液中加入 400 微升 1 毫克/毫升的 DNase I 溶液，并在室溫下孵育 15 分鐘，每 5 分鐘輕輕攪拌或搖晃試管。

F、將含有分散細(xì)胞的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的 15 毫升管中。留下約 50 微升含有碎片的 THRYVE 胚胎完quan培養(yǎng)基。可選：通過(guò) 70 微米的細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾細(xì)胞溶液。

G、以 1100 轉(zhuǎn)/分（200×G）離心 1 分鐘。棄去上清液，留下約 50 微升含有沉淀物的 THRYVE 胚胎完quan培養(yǎng)基。

H、分散細(xì)胞團(tuán)（用手指或試管輕彈管底），然后將細(xì)胞團(tuán)重新懸浮于 1 毫升的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（NbAstro™）中。

I、將 20 微升細(xì)胞溶液分裝到含有 80 微升臺(tái)盼藍(lán)（1:5 稀釋）的 0.5 毫升管中。

J、使用血細(xì)胞ji數(shù)器（計(jì)算細(xì)胞/毫升）或采用當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)室程序來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞。 （2）細(xì)胞培養(yǎng)（無(wú)菌室中的室溫）

A、用 0.2 毫升/平方厘米的 NbAstro™ 稀釋細(xì)胞，并以 7500 個(gè)細(xì)胞/平方厘米或期望的濃度進(jìn)行鋪板。注意：以更高的密度鋪板會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的混合。

B、孵化時(shí)間37 ℃、5%的二氧化碳2、9%的氧氣2、95%的濕度（或環(huán)境濕度O2 )）

C、 每 3 - 4 天用新鮮的、37℃、二氧化碳平衡的 NbAstro 更換一半的培養(yǎng)基。

D、1.5 至 2 周后，星形膠質(zhì)細(xì)胞將有 90%融合，準(zhǔn)備收獲或傳代。

E、若要轉(zhuǎn)移到神經(jīng)元培養(yǎng)物中：提前 24 小時(shí)，將一半的培養(yǎng)基更換為 Neurobasal®/B27®/GlutaMAX™（NbActiv1™）。

F、對(duì)于擴(kuò)增：用 0.25%胰蛋bai酶在 THRYVE 胚胎培養(yǎng)基中收獲細(xì)胞，(37 ℃，5 分鐘）。

G、若要抑制胰dan白酶，請(qǐng)使用dan蛋白酶抑制劑或血清。

（3）活力測(cè)定：

A、用 37 ℃平衡yan溶液（0.2 毫升/平方厘米底物）沖洗兩次。

B、從 15mg/ml 熒光素二乙酸酯的丙酮儲(chǔ)備液和 4.6mg/ml 碘化丙啶的水溶液儲(chǔ)備液中制備染色液，將每種溶液稀釋 15 微升至 1.5 毫升的 HBSS 中（1:100 稀釋）。

C、將步驟 B 中的 20 微升染料混合物添加到步驟A中添加的每 0.2 毫升的 HBSS 中（1:10 稀釋）。

D、約 1 分鐘后，使用適合熒光素?zé)晒獾乃{(lán)色激發(fā)來(lái)計(jì)數(shù)活細(xì)胞（綠色細(xì)胞）。使用綠色激發(fā)來(lái)計(jì)數(shù)碘化丙啶熒光（小紅色細(xì)胞核）的死細(xì)胞。

E、活力 =（綠色細(xì)胞/單位面積）/（單位面積上鋪板的總細(xì)胞數(shù)） 或者存活率 = 綠色細(xì)胞/（綠色細(xì)胞 + 紅色細(xì)胞）